共同研究・競争的資金等の研究課題

• 大腸癌の前癌状態と考えられる急性虫垂炎の予防法開発のための基礎的研究
  基盤研究(C)
  埼玉医科大学
  2020年04月01日 - 2023年03月31日
  虫垂炎に対する予防法を確立することを目的として以下の検討をおこなった。
  Ⅰ：小児の口腔内細菌叢・腸内細菌叢および虫垂内細菌叢の分析を行い、虫垂炎に特徴的な細菌叢を特定する。
  Ⅱ：正常小児の口腔内・腸内細菌叢および生活習慣の分析から細菌叢の分類を行い、虫垂炎に相関する生活習慣・細菌叢を特定する。
  虫垂炎症例19例、正常小児36例の上記細菌叢を１６S解析より分析した結果、600種以上の細菌が検出された。細菌分類における科（Family）における細菌叢の解析を行ったところ、虫垂炎の虫垂細菌叢は、フゾバクテリウム科細菌等の口腔内細菌が優勢で、全体の５４．７％を占めており、虫垂内の嫌気性条件は、特に口腔内の偏性嫌気性菌にとって有利であり、虫垂炎に際して炎症の進行に関与していると推察された。虫垂炎群と健常群の便の細菌叢の比較では、 健常群では虫垂炎群より、ラクノスピラ科細菌が増加していた。健常群において便内のフゾバクテリウム陽性例と陰性例を比較したところ陰性例ではラクノスピラ科細菌が増加していた。フゾバクテリウム陽性例は、年長児に多い傾向があった。生活習慣、既往歴の分析では発酵食品嗜好例ではラクノスピラ科細菌が増加していた。また虫垂炎群の齲歯罹患率は31.6％、健常群は8.3％と優位差があったが、虫垂炎群は年齢が高い傾向にあった。
  症例数が少なく、口腔と腸内細菌叢の相関性を示唆する因子の同定には至っていない。腸内細菌叢の多様性を獲得する小児期に、フゾバクテリウム科細菌などの口腔内細菌が腸内に移行していると考えられるが、短鎖脂肪酸産生菌であるラクノスピラ科細菌が優勢な腸内細菌叢ではフゾバクテリウム科細菌が少数であった。
• 難治性小児消化器疾患の医療水準向上および移行期・成人期の QOL 向上に関する研究　　　　　　　　　　　　　　　
  2020年04月01日
• 小児排泄機能障害者のトランジションのための医療・看護に関する包括的調査研究
  基盤研究(C)
  山梨大学
  2014年04月 - 2018年03月
  北米におけるトランジションプログラム等の概要を示した報告をもとに、イリノイ州のDSCC(The Division of Specialized Care for Children) から出されている「Transition Tool Kit」を参考にチェックリストを検討した。
  3名の排泄機能障害者に質問紙を使って調査した。その結果、①健康管理技術と能力、②薬物/処置技術と能力、④保険に関する技術と能力はほぼ獲得されていた。また、成人外科領域であるストーマ・排泄リハビリテーション学会(第33回)を主催し、パネルディスカッションにおいて、排泄機能障害児の成人医療へのトランジションの討論ができた。
• ペプチド抗原法による抗N-mycがん遺伝子産生蛋白抗体の精製とその多目的利用
  基盤研究(C)
  東京大学
  1996年 - 1997年
  N-myc遺伝子の増幅は、神経芽細胞腫の予後を反映することが知られているが、その遺伝子産物であるN-Myc蛋白の発現を調べるために抗N-Myc抗体を精製した。N-Myc蛋白の既知のアミノ酸配列の中から二種のペプチドHGRGPPTAGSTAQSPG(codon.136-151)およびGVAPPRPGGRQTSGGDH(codon.223-239)を選び、これを合成し、lisine coreにmultiple antigen peptide(MAP)methodにより結合させ、抗原として家兎に免疫した。得られた家兎血清のIgG分画をアフィニティ・カラムにかけて精製した。精製されたIgGの特異性を検定したところ、抗GVAPPRPGGRQTSGGDH特異IgGは、N-myc遺伝子の発現が知られているヒト神経芽細胞腫の細胞株についてN-Myc蛋白と思われるバンドの発現を示したが、ヒト横紋筋肉腫細胞株や、ヒトユーイング肉腫細胞株では反応を示さなかった。また、免疫染色においても、抗GVAPPRPGGRQTSGGDH特異IgGによりN-myc遺伝子の発現が知られているヒト神経芽細胞腫の細胞株の核内に強い染色がみられ、抗GVAPPRPGGRQTSGGDH特異IgG(anti-17M)は抗N-Myc蛋白ポリクローナル抗体であると考えられた。
  さらにその他の神経芽細胞腫細胞株およびxenograft、神経節芽腫組織、正常副腎組織、横紋筋肉腫細胞株、ユーイング肉腫細胞株、肺小細胞癌細胞株を用い、上記抗GVAPPRPGGRQTSGGDH特異IgG(anti-17M)を用いてimmunoblotおよび免疫染色を行ったところ、N-myc遺伝子の増幅のある腫瘍においてのみ陽性の反応がみられた。
• myc系oncogene産生蛋白の定量的測定法の確立とその臨床的意義の評価
  基盤研究(B)
  東京大学
  1995年 - 1996年
  神経芽細胞腫のがん遺伝子であるN-mycの異常発現を、その産物であるN-Myc蛋白の定量により知ることは極めて重要である。平成7年度、並びに、平成8年度の2年間、サンドウィッチ型ELISA法の確立を目標として、以下の研究を行った。
  (1)MYC系遺伝子間で相同性の高い領域(pan-myc領域)を含むDNA断片よりpan-Myc蛋白を精製して、家兎に免疫し、ポリクローナル抗体が既に得られている。これをELISA法における第一抗体として用いることとした。
  (2)N-Myc蛋白全体の中から本蛋白に特異的し考えられる2種のペプチドを選び、これらを合成し、MAP法にて家兎を免疫、ポリクローナル抗体を得た。上記の2種のペプチドのうち、17個のアミノ酸(codon223-239)からなるペプチドより、特異性が高く、抗体価のいちじるしく高い抗体が得られ、アフィニティカラムにより抗N-Myc蛋白特異IgGにまで精製することができた。
  (3)ELISA法のための標準蛋白として、N-mycDNAのうちexon2とexon3から一定の長さのDNAをクローンし、発現ベクターpET16bに挿入、大腸菌によりN-Myc蛋白を得た。本蛋白は、大きさが38kDaと本来のN-Myc蛋白よりもやや小さいが水溶性(本来のN-Myc蛋白は水に難溶性)であることが確認された
  (4)続いて、ELISAによる定量法の樹立の実験に移ったが、このとき、今までに度々行ってきた予備実験により、確保されている筈の抗pan-Myc蛋白抗体の量が予想外に少なくなっていることが明らかとなり、これだけの第一抗体の量ではサンドウイッチ型ELISA法は組めないものと結論した。現在、標準蛋白をI^<131>で標識して競合反応を行わせるRIA法の実験に移行している。
• 神経芽細胞種におけるアポトーシス・エンドヌクレアーゼの分子生物学的研究
  基盤研究(B)
  東京大学
  1995年 - 1996年
  昨年の研究で神経芽細胞腫(以下本症と略す)培養細胞株16種を入手し、アポトーシス誘導剤(アクチノマイシンD、アドリアマイシン、カンプトテシン)によるアポトーシス発現を検討した。その結果、本症培養細胞株は、アポトーシスのDNA断片化の観点より、大断片化すら誘発されない株、大断片化のみ起こる株、およびヌクレオソーム単位でのDNA断片化による典型的なladder structureを示す小断片化まで誘発される株の3種類に分類することが出来た。
  本年度はDNA大断片化を司るDNaseλに関して、本症培養細胞株TGW株(DNaseλ活性陽性)とGOTO株(同酵素活性陰性)を用いて比較検討することによって本酵素の同定研究を進めた。TGW株の細胞核を用いたautodigestionの系においてDNA大断片化のin vitroでの再現を目指したところ、約20kbのDNA断片の生成が確認され、細胞レベルで観察されるDNA大断片化がin vitroで再現できることが確認された。
  このautodigestionの系を用いて、DNA断片化を示さないGOTO株およびヌクレオソーム単位でのDNA断片化を示すSK-N-SH株について、in vitroにおけるDNA断片化の再現を検討した。その結果、いずれの株においても細胞レベルで観察されるDNAの状態が再現された。
  また、ヌクレオソーム単位でのDNA断片化を司るDNaseとしてDNaseγが報告されているが、本症培養細胞株の代表的な3株(TGW株、GOTO株、SK-N-SH株)におけるDNaseγの遺伝子解析を目的としたサザン、ノーザンブロッティング解析のために、各培養細胞株を凍結した。
• 総レニン濃度の診断的意義に関する臨床的ならびに病理組織学的研究
  一般研究(B)
  東京大学
  1992年 - 1993年
  ウイルムス腫瘍に関し、特異的腫瘍マーカーと呼ぶべきものは知られていない。レニンには、活性型レニンのほかにその前駆体である不活性型レニンがあり、血漿中、不活性型レニンは総レニン(活性型+不活性型)の70〜90%を占めている。1985年に不活性型レニンが本腫瘍の腫瘍マーカーになり得るとの報告があるので、ヒトレニン特異モノクローナル抗体によるRIA法にて血漿中の総レニン濃度を測定し、これが本腫瘍の腫瘍マーカーとなり得るか否かについて検討した。まず、予備研究により西浦らが開発したRIA系が総レニン濃度の測定系であることを、酵素法則値との比較、並びに、免疫組織染色により確認した。小児期における血漿中総レニン濃度の正常範囲上限を301pg/mlと定めたが、ウイルムス腫瘍患者13例における血漿総レニン濃度は231pg/mlから1289pg/mlの範囲に分布、13例中9例が正常範囲上限を越える値を示した。術前術後で血漿総レニン濃度を比較したら5症例では、全例、術後にその値の低下がみられた。本腫瘍の病期と血漿総レニン濃度との間に関係は見られなかった。先天性間葉芽腎腫の2例はいずれも正常範囲上限を大きく越える異常高値を示した。この2症例のうちの1例について免疫組織染色を行ったところ、腫瘍に取り込まれた遺存傍糸球体装置のみが特異的に染色され、先天性間葉芽腎腫におけるレニン産生の機序はウイルムス腫瘍の場合と若干異なるのと考えられた。多嚢腎の2症例において血漿総レニン濃度は異常高値を示した。本疾患においては、高血圧症や血漿レニン活性の高値がしばしば報告されているが、血漿総レニン濃度としての測定は本研究がはじめてである。神経芽細胞腫16症例はいずれも正常範囲内の血漿総レニン濃度を示した。尚、肝芽腫の5例中3例と、奇形腫の10例中1例が異常高値を示し、腎外性レニン産生の例と考えられた。