共同研究・競争的資金等の研究課題

• 台湾ハブ毒由来血栓溶解剤の開発
  基盤研究(C)
  帝京平成大学
  2017年04月01日 - 2020年03月31日
  ガラガラヘビ毒由来メタロプロテアーゼ断片（Alfimeprase）は、強力なフィブリン塊分解活性をもつが出血活性はもたず、且つrtPA（組換え組織型プラスミノゲンアクティベータ）のような副作用が予想されないため、米国で血栓溶解剤として臨床開発された。しかし、生理的条件下において、Alfimepraseは血清中のα2-macroglobulin （α2M）により不可逆的、且つ迅速に不活性化されるため、期待された血栓溶解効果は見られなかった。本研究では、Alfimepraseのホモログである台湾ハブ毒由来タンパク質TM3（Fibrinlysin）に着目し、研究を進めた。
• ボンビコール産生細胞におけるフェロモノジェネシスの分子機構
  基盤研究(B)
  独立行政法人理化学研究所
  2008年 - 2010年
  ガ類昆虫の性フェロモンがフェロモン腺細胞で脂肪酸合成経路を介して生合成されることは広く認められているが、性フェロモン産生の分子メカニズムの詳細は理解されていない。我々はカイコガの性フェロモンであるボンビコール産生のカスケードでキーとなる様々な機能分子の遺伝子を同定するとともにその機能を実証することで、カイコガにおける性フェロモン産生機構の全貌をほぼ解明することができた。
• カイコガ純系系統P50 を用いたRNAi の確立、及び鱗翅目昆虫全般への応用
  基盤研究(C)
  独立行政法人理化学研究所
  2007年 - 2008年
  チョウ目(鱗翅目)昆虫でのRNA 干渉(RNAi)法の確立を目指し、カイコガ純系系統P50 を用いてRNAi 効果の検証を行った。その結果、性フェロモン産生器官であるフェロモン腺で発現する遺伝子に対して、RNAi は効果的に作用することが確認できた。カイコガ性フェロモン(ボンビコール)産生メカニズムに関与する機能分子の機能解析にRNAi を利用した結果、lipase、Perilipin、FATP を含む新規8 遺伝子がボンビコール産生に関与することが示された。
• フェロモン腺におけるガ類性フェロモン産生機構の包括的解析
  基盤研究(B)
  独立行政法人理化学研究所
  2005年 - 2007年
  本研究では、カイコガを用い、ガ類昆虫がフェロモン腺で種固有の性フェロモンブレンドを生み出すメカニズムを包括的に解析し、その全体像を明らかにしようと試みた。カイコガの性フェロモン(ボンビコール)産生はフェロモン腺細胞がペプチドホルモンPBANの刺激を受けて促される。我々は、PBAN受容体(PBANR)遺伝子のクローニングに成功し、これが413アミノ酸からなる7回膜貫通型Gタンパク質結合型受容体(GPCR)であることを明らかにした。また、フェロモン腺でのRNAi法を確立し、フェロモン腺特異的遺伝子(desat1, pgACBP, mgACBP, pgFAR, PBANR)産物が実際にボンビコール産生に関わっていることをin vivoで実証するとともに、pgACBPがボンビコール前駆体脂肪酸の貯蔵体である脂肪滴の形成に直接関与することを明らかにした。また、ボンビコール産生に関わる新規遺伝子を同定するために、カイコガの公開ESTデータベースを解析し、フェロモン産生に関与している可能性の高いと予想される88個のクローンについてRT-PCRによる組織特異的解析を行い、25クローンがフェロモン腺で優先的に発現することを明らかにした。さらに、これらの遺伝子をRNAiで発現抑制することで、ひとつの遺伝子が脂肪滴からボンビコール前駆体を切り出すリパーゼをコードしていることを示した。また、カイコガにおいてPBAN刺激に伴ってリン酸化されるタンパク質を抗-リン酸化アミノ酸抗体を用いたImmunoblot解析で検索し、リン酸化を受ける5種類のバンドを検出し、そのうちの1つが、脂肪滴表面に会合して脂質分解で制御するLipid storage droplet protein 1 (Lsdp1)であることが示唆された。
• 昆虫の性フェロモンカスケードの分子メカニズムに関する研究
  若手研究(B)
  独立行政法人理化学研究所
  2003年 - 2004年
  アシル-CoA結合タンパク質(ACBP)は、長鎖脂肪酸アシル-CoAの保護、輸送に関与する低分子タンパク質で、生物種間で広く保存されている。これまでに、我々は、カイコガフェロモン腺からACBP(pgACBP)をクローニングしており、この遺伝子がフェロモン腺内で特異的に発現し、羽化1日前の蛹でその転写量が急激に増加することは既に報告済みである。またフェロモン産生細胞には、油滴状顆粒が数多く存在し、その中には性フェロモン前駆体となるトリアシルグリセロールが豊富に含まれている。以上のことから、pgACBPは、カイコガ性フェロモン(bombykol)生合成に深く関与すると考えられる。本研究では、bombykol生合成メカニズムの上流部分で重要な役割を果たすpgACBPの転写活性化因子の精製、解析を行った。
  血清サンプルをHPLCで分離し、pgACBPの転写を誘導する単一ピークを得た。MS、NMR解析の結果、β-D-glucosyl-O-L-tyrosineであることが分かった。昆虫の体液中にβ-D-glucosyl-O-L-tyrosineが存在することは既に報告されているが、その直接的な機能は分かっていなかった。
  β-D-glucosyl-O-L-tyrosineは、pgACBPの転写のみを特異的に調節し、他のフェロモン腺特異的遺伝子の転写には関与しない。また、その血中濃度は、羽化4日前から増加し始め、羽化直前まで高い濃度を維持する。この体液中の濃度上昇が、pgACBPの転写量増加の引き金を引く。さらにIn vitroの実験から、β-D-glucosyl-O-L-tyrosineは、直接フェロモン腺内に入り込み、pgACBPの転写量を増加させると考えられる。以上のことから、β-D-glucosyl-O-L-tyrosineは、pgACBPの転写制御に深く関与することが示唆された。
• 害虫制御を目指したホルモンによる昆虫機能発現機構の包括的解析
  萌芽研究
  独立行政法人理化学研究所
  2002年 - 2003年
  昨年度に引き続き、神経ホルモンPBANにより制御されるカイコガ性フェロモン産生系をモデルとして、ホルモンによる昆虫機能発現の分子機構解析を試みた。すなわち、カイコ純系系統p50フェロモン腺の平均化cDNAライブラリーなどから浮き彫りにしたフェロモン腺特異的遺伝子の解析を行い、'フェロモン成分の種特異性を規定するキー酵素である不飽和化酵素(Ds1)およびアシル基還元酵素(pgFAR)の性質(基質特異性など)をまず明らかにした。次いで、これらのフェロモン生合成酵素遺伝子の異種生物での発現を試み、カイコガ性フェロモン(ボンビコール)を自ら産生する酵母の形質転換体の作製に成功した。これらの手法は植物などの異種生物にフェロモン生合成酵素遺伝子を導入・発現し、これをフィールドに用いることで標的ガ類の配偶行動を撹乱するという、新たな選択性の高い安定した害虫制御技術の開発に道を拓くものである。
  一方、機能発現に関わる昆虫遺伝子の機能を包括的に解析するツールとして、カイコでのジーンターゲッティング法の開発に向けた方法論の確立を試み、本年度は、Golicら(2000)によって開発された相同組み換えによるジーンターゲティング法を考慮し、カイコへの適用を開始した。現在、この手法の実施に必要なFLP部位特異的リコンビナーゼとI-SceIエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコの作成と、標的配列に相同なDNAから成るドナーコンストラクトの構築を進めているが、この最新の形質転換技術をカイコでの系に応用することはノックアウトカイコの作製を可能とするものである。